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1,3-PDO（1,3-丙二醇）是一种高价值精细化学品，在化妆品、医药和塑料制造等领域具有多种应用，可用于合成聚酯和聚氨酯。1,3-PDO 化学合成法通过丙烯醛和环氧乙烷的羰基化反应实现，但该方法存在使用有毒物质、需高压等条件，相比之下，微生物发酵法已成为一种经济高效且环境友好的 1,3-PDO 生产技术。【生物基科技】获悉，近日，江南大学生物工程学院刘立明教授、高聪副研究员团队通过FMME-KP（一种肺炎克雷伯菌菌株）的系统代谢工程，菌株FMME-51在48小时内可生产138.6 g/L 1,3-PDO，产量达到0.52g/g，且无需额外添加VB12（以纯甘油为底物）。此外，该菌株以粗甘油为底物，1,3-PDO产量达到122.7 g/L，这是迄今为止已报道的微生物1,3-丙二醇产量和产率最高的菌株。

相关研究成果以“Systems metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for high-level 1,3-propanediol production”为题，发表在《Metabolic Engineering》上。

优化副产物合成基因，1,3-PDO 效价显著提升

菌株 FMME-01 在 48 h 内可产 1,3-PDO 67.2 g/L，甘油产率达 0.36 g/g，但检测发现该菌株会产生多种副产物，显著降低了 1,3-PDO 的产率。为了提高1,3-PDO产量，依次破坏或下调了FMME-01中与副产物合成相关的基因。经过筛选，摇瓶实验中菌株FMME-14 1,3-PDO 效价最高（3.38 g/L）。发酵过程中合成途径酶表达量的提高，可显著增强菌株的 1,3-PDO 生产性能。

图 1. 1,3 - 丙二醇（1,3-PDO）生物合成途径的强化（A）菌株 FMME-01 在 5 L 发酵罐中的生产性能评估。缩写：1,3-PDO=1,3 - 丙二醇；2,3-BDO=2,3 - 丁二醇；ACE = 乙酸；LAC = 乳酸；EtOH = 乙醇。（B）不同工程菌株中 1,3-PDO 的效价与产率。（C）摇瓶发酵中精细调控生物合成途径酶对 1,3-PDO 产量的影响。缩写：H=Ptac+34（高强度启动子与核糖体结合位点组合）；M=Pfic+30（中强度组合）；L=PdhaT+64（低强度组合）。（D）菌株 FMME-14 在 5 L 发酵罐中的生产性能评估。数据以 3 次（n=3）生物重复实验的平均值 ± 标准差（mean ± s.d.）表示。

优化基因，改造细胞膜组成，耐受性提升62.5%，死亡率降低41.2%

高 1,3-PDO 浓度引发的渗透压升高会抑制 FMME-14 的细胞生长。通过筛选出对 1,3-PDO 浓度变化显著响应的基因，将这些靶基因的启动子片段与报告基因 eGFP 融合，构建启动子文库，从中筛选出 1,3-PDO 响应型启动子 Pᵧᵧₐₘ。将最优启动子 Pᵧᵧₐₘ₃与报告基因 eGFP 结合，获得Pᵧᵧₐₘ₃-eGFP 。将携带 Pᵧᵧₐₘ₃-eGFP 的 FMME-14 作为出发菌株进行短期进化实验（约 300 代），获得最优菌株 FMME-24 ，将突变基因 ydaML63V 及缺失替换基因 pgaD共同整合到 FEV-24 中，构建得到菌株 FMME-38。

FMME-38 的 1,3-PDO IC₅₀值为 130 g/L，耐受性提升 62.5%（图 3E），在 5 L 发酵罐中发酵 48 h 后，FMME-38 的 OD₆₀₀、1,3-PDO 效价与产率分别为 18.84、109.5 g/L 和 0.45 g/g（图 3F），细胞死亡率降低 41.2%。结果表明，对细胞膜组成的改造及 1,3-PDO 耐受性的提升，在增强工程菌株 FMME-38 的细胞耐受性与生产性能中发挥关键作用。

图 2. 进化菌株的高通量筛选（A）Pᵧᵧₐₘ启动子的突变体。（B）不同工程化启动子相关荧光强度的表征。（C）不同 1,3 - 丙二醇（1,3-PDO）浓度下的流式细胞术分析。（D）菌株 FMME-19 的荧光强度测定。（E）菌株 FEV-24 的半抑制浓度（IC₅₀）测定。（F）菌株 FEV-24 在 5 L 发酵罐中的生产性能评估。数据均来自 3 次生物重复实验。

图3. 1,3 - 丙二醇（1,3-PDO）耐受性靶标的反向代谢工程（A）添加 80 g/L 1,3-PDO 的摇瓶发酵中，测定不同菌株的细胞生长（情况）与 1,3-PDO 效价。（B）实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）分析验证基因转录水平的变化。（C、D）半定量结晶紫实验与菌株生长实验验证靶基因通过促进细胞膜形成以提升菌株耐受性。缩写：OE = 过表达（over expression）。（E）菌株 FMME-38 在 5 L 发酵罐中的生产性能评估。（F）菌株 FMME-38 的 1,3-PDO 半抑制浓度（IC₅₀）测定。数据以 3 次（n=3）生物重复实验的平均值 ± 标准差（mean ± s.d.）表示。

强化胞内VB12合成与NADH再生，无需外源添加，增效降本

FMME生产1,3-PDO的过程中，甘油脱水酶依赖维生素 B12（VB12），而1,3-PDO氧化还原酶依赖NADH。

通过将VB12 合成靶基因（cobB、cobS、cobC）整合到基因组中，发酵 24 h 时，FMME-48 的 VB12 浓度达 50.8 μg/L，FMME-48 的 1,3-PDO 效价达到 118.3 g/L，产率达到 0.46 g/g。结果表明，增强 VB12 生物合成与甘油代谢相关的多个基因表达会产生积极影响；这种间接调控作用提升了甘油利用率，显著增加了 FMME-48 的 1,3-PDO 产量。

将含 NADH 供应模块的 pEtac-Xm 质粒与含 NADH 调控元件的 pEtac-RDhaT 质粒整合，构建得到 pEtac-Mx 质粒，将其导入 FMME-48，最终获得菌株 FMME-51。FMME-51 的 NADH/NAD⁺比值较 FMME-48 提升 31.3%；摇瓶实验中，其 1,3-PDO 效价达 4.85 g/L，较 FMME-48 提升 12.3%（图 5E）。结果表明，动态 NADH 调控可有效实时调节胞内氧化还原平衡，优化碳通量分布，从而显著提升 1,3-PDO 的生物合成效率。

图 4. 肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）胞内维生素 B12（VB12）合成的强化（A）肺炎克雷伯菌 VB12 生物合成途径中酶的表达变化，展示各基因的表达水平变化；筛选出 9 个持续下调的基因进行过表达研究。缩写：HBA = 氢钴胺酸（Hydrogenobyrinic acid）；AdoCby = 腺苷钴胺素（Adenosylcobyrate）。（B）摇瓶发酵结束时（24 h），菌株 FMME-39 至 FMME-47 的 VB12 积累量。（C）摇瓶实验中，菌株 FMME-39 至 FMME-47 的 1,3 - 丙二醇（1,3-PDO）产量。（D）菌株 FMME-48 在 5 L 发酵罐中的生产性能。数据以 3 次（n=3）生物重复实验的平均值 ± 标准差（mean ± s.d.）表示。

图 5. 基于生物传感器的动态 NADH 再生系统构建与评估（A）基于生物传感器的动态 NADH 再生系统示意图。（B）菌株 FMME-48 与 FMME-49 的 NADH/NAD⁺比值。（C）激光共聚焦显微镜观察显示，Rex 蛋白的表达量会随 NADH/NAD⁺比值的高低呈现不同荧光强度。（D）在高、低 NADH/NAD⁺比值条件下，Rex 蛋白表达与否的荧光强度对比。（E）基于生物传感器的动态 NADH 再生系统效能验证。数据均来自 3 次生物重复实验。

优化甘油流加速率与 pH，达到最佳效价与转化率

为提升菌株 FMME-51 的生产性能，研究对甘油流加速率与 pH 进行了优化。通过优化流加速率，1,3-PDO 效价提升至 131.5 g/L，转化率达 0.51 g/g，较优化前分别提升 5.0%、8.5%；副产物积累量也降至 10.1 g/L（2,3-BDO）与 9.4 g/L（乙酸）。进一步单因素实验表明，将 pH 维持在 6.8 时，1,3-PDO 效价可提升至 135.9 g/L（图 6C）。

整合上述优化条件后，FMME-51 的 1,3-PDO 效价达 138.6 g/L，转化效率达 0.52 g/g（图 6D、图 S15），较 FMME-01 分别显著提升 118.6%、44.5%；同时，副产物水平大幅降低，2,3-BDO、乙酸、乳酸、乙醇浓度分别降至 8.2、7.4、0、0 g/L，较 FMME-01 分别降低 55.0%、51.6%、100%、100%。

为评估其工业化潜力，以低成本粗甘油为底物对 FMME-51 进行测试（图 6E）：在 5 L 发酵罐中，FMME-51 的 1,3-PDO 效价达 122.7 g/L，对粗甘油的产率为 0.42 g/g，生产强度为 2.56 g/（L・h）（图 6F）；乙酸与 2,3-BDO 的积累量分别为 8.8 g/L、10.5 g/L。值得注意的是，菌株生长未受粗甘油中有毒化合物的影响，展现出较强的耐受性，凸显其在工业化规模生产中的巨大潜力。

图 6. 菌株 FMME-51 在 5 L 发酵罐中的发酵优化（A）FMME-51 补料分批发酵中的初始恒定甘油流加策略及残余甘油（变化情况）。（B）FMME-51 补料分批发酵中的优化甘油流加策略及残余甘油（变化情况）。（C）补料分批发酵中不同 pH 条件对 FMME-51 产 1,3 - 丙二醇（1,3-PDO）的影响。（D）FMME-51 在最优工艺下的补料分批发酵（结果）。（E）FMME-51 分别以纯甘油和粗甘油为底物的补料分批发酵（对比）。（F）FMME-51 使用粗甘油为底物时的生产性能评估。数据以 3 次（n=3）生物重复实验的平均值 ± 标准差（mean ± s.d.）表示。

总结与展望

研究团队采用代谢工程、菌株进化和辅因子工程相结合的综合方法，成功开发出一株高效的1,3-丙二醇生产肺炎克雷伯菌。这项研究代表了1,3-丙二醇生物合成领域的重大进展，实现了前所未有的产量和效价，同时无需添加昂贵的VB12，从而大幅降低了生产成本。此外，工程菌株FMME-51能够高效利用粗甘油作为底物，1,3-丙二醇产量为122.7 g/L，产率为0.42 g/g，生产率为2.56 g/(L·h)，这是迄今为止报道的基于粗甘油的1,3-丙二醇生产的最高产量。然而，转化效率和生产率仍需进一步提高，可通过提高甘油吸收能力和改进发酵策略来实现。研究结果证明了工业规模 1,3-PDO 生产的潜力，并为设计非模型微生物合成高价值化学品提供了有价值的框架。